Von Jon Fleetwood
Forschungsergebnisse aus Fort Detrick stellen die Zuverlässigkeit des Tests zur Erfassung von Ebola-Fällen in Frage.
Eine mit dem US-Militär verbundene Studie, die 2023 in Scientific Reports veröffentlicht wurde, zeigt, dass sich die Ergebnisse von Ebola-RT-PCR-Tests je nach der Art und Weise änderten, wie die synthetischen Primer und Sonden des Assays entwickelt wurden – wobei dieselben menschlichen Proben unter einer Ebola-PCR-Konfiguration negativ und unter einer anderen positiv getestet wurden.
PCR-Tests werden derzeit verwendet, um Ebola-Fälle zu erfassen, was Regierungen wiederum als Rechtfertigung für Quarantänen und andere autoritäre Maßnahmen zur Bekämpfung von Ausbrüchen nutzen.
Wenn es jedoch Grund gibt, an den Tests selbst zu zweifeln, dann gibt es auch Grund, an der Reaktion der Regierung auf die durch sie ermittelten „Fälle“ zu zweifeln.
Die Studie, die von Forschern des U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases (USAMRIID) durchgeführt und teilweise von der Defense Threat Reduction Agency (DTRA) finanziert wurde, widerlegt direkt die Vorstellung, dass Ebola-PCR-Tests ein feststehendes, stabiles oder sich selbst validierendes Diagnosesystem darstellen.
Die Studie wurde finanziert durch:
- „Defense Threat Reduction Agency (DTRA) und die Armed Forces Health Surveillance Division (AFHSD), Abteilung Global Emerging Infections Surveillance (GEIS).“
Dem Artikel zufolge:
„Der Vergleich der Leistungsfähigkeit des neuen Assays mit den bisherigen Assays anhand einer Reihe von menschlichen EBOV-Proben bestätigte eine erhöhte Assay-Empfindlichkeit, was sich in niedrigeren Cq-Werten widerspiegelte und dazu führte, dass drei Proben als positiv identifiziert wurden, die mit dem ursprünglichen Assay negativ getestet worden waren.“
Mit anderen Worten: Dieselben menschlichen Proben führten zu widersprüchlichen Ebola-Testergebnissen, je nachdem, welche Konfiguration aus synthetischen Primern und Sonden verwendet wurde.
In der Veröffentlichung wird wiederholt eingeräumt, dass winzige Sequenzabweichungen zwischen den Primern/Sonden des Assays und der beabsichtigten Zielsequenz die Ebola-Testergebnisse wesentlich veränderten.
Laut der Studie:
„können Abweichungen in der Primer- oder Sondensequenz und dem Zielorganismus zu verminderter Empfindlichkeit, Assay-Fehlern und falsch-negativen Ergebnissen führen.“
Die Forscher fanden heraus, dass bereits ein oder zwei Nukleotid-Abweichungen das Amplifikationsverhalten dramatisch veränderten.
In der Veröffentlichung heißt es:
„Ein oder zwei Primern- oder Sonden-Fehlpaarungen führten zu Auswirkungen, die von minimal bis zu einer Verringerung der Sensitivität um fast zwei Log-Stufen reichten.“
Die Studie berichtete weiter:
„Eine einzelne Fehlpaarung zwischen Primer und Template hatte nur geringe Auswirkungen (<0,5 Cq-Veränderung) auf die Assay-Sensitivität, während zwei Fehlpaarungen zu einer signifikanten Auswirkung (> 4,5 Cq-Veränderung) führten.“
Die PCR-Amplifikation verläuft exponentiell, was bedeutet, dass eine Verschiebung um 4,5 Zyklen erheblich ist.
Die Studie stellte konkret fest:
„Der Reverse-Primer im Assay Ebo-TM reverse (G18A) wies bei Kikwit und Makona zwei Fehlpaarungen auf, was zu einer signifikanten Abnahme der Sensitivität um 4,9 bzw. 4,55 Cq führte.“
Die Studie räumt zudem ein, dass frühere Ebola-PCR-Systeme von Anfang an auf unvollständigen genomischen Annahmen basierten.
In der Veröffentlichung heißt es:
„Damals wurden Assays unter Verwendung der begrenzten verfügbaren genomischen Informationen entwickelt.“
Die Forscher räumten ein, dass spätere Sequenzierungen während des Ausbruchs eine zusätzliche Sequenzvielfalt bei Ebola offenbarten, die diese früheren Assays untergraben konnte.
In der Veröffentlichung heißt es:
„Die während des Ausbruchs durchgeführte schnelle Genomsequenzierung identifizierte eine genomische Vielfalt, die sich negativ auf zuvor entwickelte Assays auswirken könnte.“
Die Studie warnt wiederholt davor, dass angeblich „unentdeckte“ Sequenzvielfalt dazu führen kann, dass Ebola-positive Proben vollständig übersehen werden.
Dem Artikel zufolge:
„erhöht sich das Risiko falsch-negativer Testergebnisse aufgrund unentdeckter genetischer Vielfalt.“
Die Forscher änderten daraufhin die molekularen Erkennungsregeln des Assays selbst, indem sie die Primer und Sonden neu entwarfen und „degenerierte Nukleotide“ einführten, um die Sequenzübereinstimmung zu erweitern.
Der Studie zufolge:
„Wir haben den Ebo-TM-Test neu gestaltet, um alle derzeit bekannten EBOV-Varianten innerhalb der Testzielregion zu berücksichtigen, indem wir degenerierte Nukleotide einbauten, um die Auswirkungen von Fehlpaarungen auf die Testleistung zu mindern.“
Der neu gestaltete Test wurde anschließend computergestützt anhand von Sequenzdatenbanken validiert.
Laut der Veröffentlichung:
„Eine In-silico-Analyse ergab, dass dieser neue Test eine 100-prozentige Übereinstimmung mit 99,7 % aller EBOV-Sequenzen in GenBank aufwies.“
Die Veröffentlichung räumt zudem ein, dass der neu gestaltete Assay lediglich auf „allen bekannten“ Ebola-Varianten basierte.
Laut der Studie:
„Inklusivitätstests zeigten, dass der neue EBO-TM2-Assay alle bekannten EBOV-Varianten nachweisen konnte.“
Die Formulierung „alle bekannten“ ist bedeutsam, da sie implizit anerkennt, dass zusätzliche, noch unentdeckte Sequenzvielfalt die aktuellen Assays in Zukunft erneut untergraben könnte – genau wie neu entdeckte Sequenzvielfalt frühere Assays untergraben hat.
Die Studie legt zudem nahe, dass gemischte Sequenzpopulationen innerhalb der Proben selbst das Amplifikationsverhalten verändern könnten.
Dem Artikel zufolge:
„könnte eine kleine Viruspopulation innerhalb des EBOV-Mayinga-Stamms die Varianten enthalten, die von den G14A- und G18A-Primern erfasst werden, was zu einer leichten Verbesserung der Amplifikationseffizienz führen würde“
Entscheidend ist, dass der Artikel zwar davon ausgeht, dass der neu gestaltete Assay genauer war, die Studie jedoch nie unabhängig nachgewiesen hat, welches Assay-Ergebnis für die umstrittenen menschlichen Proben tatsächlich korrekt war.
Das bedeutet, dass in der Veröffentlichung nie unabhängig festgestellt wurde, ob der ursprüngliche Assay falsch war, der neu gestaltete Assay falsch war oder ob die widersprüchlichen positiven und negativen Ebola-Ergebnisse lediglich Artefakte sich ändernder Annahmen bezüglich der PCR-Primer und -Sonden waren.
Was die Veröffentlichung direkt belegte, war:
- eine Assay-Konfiguration lieferte negative Ergebnisse,
- eine andere Assay-Konfiguration lieferte positive Ergebnisse,
- und dieselben menschlichen Proben änderten ihre diagnostische Einstufung je nachdem, wie das PCR-System selbst gestaltet war.
Die Arbeit stellt die Ebola-RT-PCR-Testung letztlich als ein stark sequenzabhängiges molekulares Nachweissystem dar, dessen Ergebnisse maßgeblich beeinflusst werden durch:
- sich weiterentwickelnde Annahmen zur Sequenz,
- unvollständige Genomdatenbanken,
- die Gestaltung von Primern und Sonden,
- die Toleranz gegenüber Fehlpaarungen
- und laufende Entscheidungen zur Neugestaltung des Assays.
Fazit
Die Arbeit zeigt, dass sich die Ergebnisse der Ebola-PCR änderten, wenn die Primer und Sonden des Assays verändert wurden, dass dieselben menschlichen Proben unter verschiedenen Assay-Konfigurationen widersprüchliche positive und negative Ebola-Klassifizierungen erzeugten und dass neu entdeckte Sequenzvielfalt frühere Ebola-PCR-Systeme untergrub, die auf unvollständigen genomischen Annahmen basierten.
Entscheidend ist, dass die Studie zu keinem Zeitpunkt unabhängig nachweisen konnte, welches Assay-Ergebnis für die umstrittenen menschlichen Proben tatsächlich korrekt war.
Stattdessen zeigte die Arbeit, dass sich die Ebola-Diagnoseergebnisse selbst je nach der Art und Weise änderten, wie das PCR-System entwickelt wurde.
Die Studie räumt ferner ein, dass angeblich „unentdeckte“ Sequenzvielfalt auch in Zukunft die aktuellen Assays untergraben kann, genauso wie neu entdeckte Sequenzvielfalt frühere Assays untergraben hat.
Das bedeutet, dass Ebola-RT-PCR-Systeme fortwährend von unvollständigen Genomdatenbanken, sich weiterentwickelnden Sequenzannahmen, sich ändernden Primer-/Sonden-Designs, Entscheidungen zur Mismatch-Toleranz und der ständigen Neugestaltung des Assays selbst abhängig bleiben.
Wenn dieselben menschlichen Proben unter verschiedenen PCR-Konfigurationen widersprüchliche Ebola-Testergebnisse liefern können – ohne dass unabhängig festgestellt werden kann, welches Ergebnis tatsächlich korrekt war –, dann wird die Zuverlässigkeit der Tests, die zur Erfassung von Ebola-„Fällen“ und zur Rechtfertigung von Quarantänen und anderen Maßnahmen zur Bekämpfung des Ausbruchs auf der Grundlage dieser Fallzahlen verwendet werden, ernsthaft in Frage gestellt.